绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位的操作步骤是什么？

绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位的操作步骤是什么？
1．真核表达载体的构建
①引物设计
利用引物设计软件，根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物：
②载体构建
将PCR产物酶切后插入pEGFP-N1，得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。
2．转染真核细胞
当细胞生长到对数生长期时，接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时，将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中，充分混匀后，室温放置15 min，再将两种溶液充分混匀，室温放置30 min。同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞2~3次，向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基，混合后加入到培养细胞中。培养皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去双无培养液，加入2~3 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基，继续培养24~72 hr。
4．激光扫描共聚焦显微镜观察
将上述细胞分别在24、、36、48、72小时用共焦显微镜观察，采用激光扫描共聚焦显微镜，激发波长为488nm，采取图像。
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